崇城大学　薬学部　生化学研究室

大栗誉敏

☆研究背景

＊抗体医薬品について

＊抗体医薬品の問題点

＊抗体フラグメントFab

＊Fabの医薬品への応用

☆研究課題

１）抗体医薬品のFab化及び酵母による産生
２）抗体医薬Fabのアミノ酸変異導入による改変
３）Fabの体内動態の改善

４）Fabの抗原性に関する研究

　研究背景

◇抗体医薬品について

現在、抗体医薬品が盛んに開発されており、２０１8年の医薬品売り上げランキングでは抗体医薬品のヒュミラが１位であり、他の抗体医薬品も10位以内に３品目入っている。

主に、がんやリウマチなどの難治性疾患に高い効果を発揮している。

がんを例に挙げる。体の中の細胞の多くは、細胞分裂を繰り返して新しい細胞を生み出し、古くなると死んでいく。重要なのは不要な細胞が死ぬということである。

がん細胞は、正常な細胞のDNAが損傷するなどによって不死の細胞へと変化し、無限に増殖するようになった細胞である。

従来の抗がん剤による治療では、がん細胞だけでなく正常な細胞も破壊してしまうので激しい副作用を引き起こすという問題がある中で、近年の研究により、がん細胞は正常細胞ではあまり見られない分子を、細胞の表面に現れていることが分かってきた。

このがん細胞に多く現れている分子を狙えば、正常細胞を壊さずにがん細胞のみを攻撃することが可能となり、それを担っているのが抗体である。

抗体は優れた特異性を持ち、標的分子に対してのみ作用することから副作用の低減が期待できる。

がんをはじめとした病気の原因となる分子に対し、特異的に作用するのが抗体医薬品である。

さらに抗体は体内にある免疫システムの一員であるために、抗体がとらえた相手には免疫システムの他の仲間も加わって攻撃がなされる。

　

◇抗体医薬品の問題点

抗体医薬品はタンパク質である。

遺伝子工学の発展により設計図となる遺伝子さえあれば、微生物や動物細胞を使ってタンパク質を作り出すことが可能である。

抗体はタンパク質として合成されたあとＨ鎖のFc領域（下記の構造を参照）に糖鎖が付加するというイベントが必須である。

この糖鎖付加が必要なこと、そして抗体の分子が大きくて少し複雑な構造をしていることから、簡便な微生物で抗体を生産するのは難しく、

高等動物である哺乳類の細胞（主流はチャイニーズハムスターの細胞：CHO細胞）を用いて生産されている。

微生物に比べると、動物細胞の扱いは大変であり、抗体医薬品として抗体を生産する為には莫大な設備投資が必要である。

即ち、抗体医薬品の問題点の１つは、生産コストがかかるという点である。

　

◇抗体フラグメントＦａｂ

抗体医薬品は血中に最も多く存在するＩｇＧが使われている。

ＩｇＧは、Ｈ鎖が２本とＬ鎖が２本の４本のポリペプチドが組み合ってできている。

先の領域（青色）が可変領域であり、ここのアミノ酸配列が変わることによって多様な特異性を生み出している。

他の領域（赤色）は共通したアミノ酸配列の定常領域である。

Ｌ鎖と結合せずＨ鎖同士結合している部分（Ｙ字の棒の部分）をＦｃ領域と呼び、ここの特定の領域に糖鎖が付加する。

またＦｃ領域は他の免疫システムを呼び寄せるのに欠かせず、補体あるいはマクロファージやNK細胞は

抗体のＦｃ領域を認識し、抗体が捕らえた相手を殺傷する（ＣＤＣ作用・ＡＤＣＣ作用と呼ぶ）。

一方で、Ｆｃ領域を除いたＨ鎖とＬ鎖が結合している部分のフラグメントをＦａｂと呼ぶ。

Ｆａｂを単独で調製することが可能で、Ｆａｂのみで抗原（抗体が結合する分子）と結合力を維持できる。

さらに抗体分子よりも小さいので、組織に入り込める能力が高くなる。

最大の利点は、Ｆｃ領域を欠いているため糖鎖付加の必要性がなく、大腸菌や酵母といった微生物での生産が可能である。

即ち、抗体医薬品の生産コストに対して、Ｆａｂであれば生産コストは削減できる。

　

◇Ｆａｂの医薬品への応用

抗体と比べた時に、生産コストが下げられるという可能性と組織浸透性が高いという能力はＦａｂの強みである。

しかしながらＦａｂにも欠点がある。抗体分子に比べ体内の半減期が大幅に劣る。

これに対し、Ｆａｂにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付加させて体内半減期が長くなるということが分かっており、かなり抗体分子に近づいているという研究報告がある。

またＦｃ領域が無いので上述した他の免疫システムとの攻撃ができず、中和作用のみの適応に限られる。

中和作用のみで効果があるという症例には炎症性疾患のリウマチなどがあり、炎症性分子のＴＮＦαを狙ったＦａｂ製剤が認可され、

医薬品として用いられている（一般名：セントリズマブ ペゴル。商品総称名：シムジア）。

これは世界初のＰＥＧ化Ｆａｂ抗ＴＮＦα製剤であり、ＰＥＧを付加させることでＦａｂの欠点である半減期を大幅に長くしてい�驕B

もう１つの欠点であるＦｃ領域が無い為にＣＤＣ作用やＡＤＣＣ作用が期待できない事に対して、Ｆａｂ分子に抗がん剤を融合させれば

がん細胞などを特異的にかつ強力に退治できる（ADA：抗体薬物複合体）。

さらに、新しいがん治療として免疫チェックポイント阻害作用が知られている。中和作用で効果を発揮できるのでFabでの応用も期待できる。

以上のように、Ｆａｂは次世代抗体医薬品として期待が高く、研究開発が進んでいる。

　

☆研究課題

１）抗体医薬品のFab化及び酵母による産生

「抗体医薬品のFab部分を、遺伝子工学的に酵母から作りだす」

Ｆａｂは生産コストが安価で培養が容易な大腸菌や酵母などでの生産が可能である。

しかしＦａｂといえど、Ｈ鎖Ｌ鎖の別々からなる２量体であるため大腸菌や酵母の生産系を確立するのは容易ではない。

以前の研究で、ヒトのＦａｂを大腸菌から封入体として発現させ大量にかつ効率的に作製させる事にした。

[Stable supply of large amounts of human Fab from the inclusion bodies in E. coli.

Fujii T, Ohkuri T, Onodera R, Ueda T. J Biochem. 2007. 141(5):699-707. ]

また、酵母によっても大量にヒトのＦａｂを大量に調製することに成功した。

[Characterization of deamidation at Asn138 in L-chain of recombinant humanized Fab expressed from Pichia pastoris.

Ohkuri T, Murase E, Sun SL, Sugitani J, Ueda T. J Biochem. 2013. 154(4):333-340. ]

さらに抗体医薬品アダリムマブ（ヒュミラ）のFabを酵母より大量に調整することにも成功した。

[A novel engineered interchain disulfide bond in the constant region enhances the thermostability of adalimumab Fab.

Nakamura H, Oda-Ueda N, Ueda T, Ohkuri T. Biochem Biophys Res Commun. 2018. 495(1):7-11.]

現在、承認されている抗体医薬品について、Ｆａｂの発現系を構築させ酵母を用いて大量に調製する研究をおこなっている。

　

２）抗体医薬Fabのアミノ酸変異導入による改変

「熱に強いFabや凝集性を抑えたFabを作る」

抗体はタンパク質であるため熱に弱い。タンパク質製剤は精製や保存段階で不可逆的な化学修飾反応や凝集などが起こる可能性があり、品質の不均一化、活性の低下を招くおそれがある。

そのため抗体医薬品は冷所で１〜２年の保存期間となり、これもコストが高くなる要因の１つとなっている。

タンパク質は水溶液中で天然状態と変性状態の平衡関係にあり、不可逆的な劣化反応は、変性状態から引き起こされる。

従って、タンパク質の天然構造を安定化すれば劣化反応の進行を抑制することができ、長期保存が可能になると考えられる。

そこでFabの定常領域をターゲットとしてアミノ酸変異による熱安定化を目指している

これまでに抗体医薬アダリムマブFabの定常領域に新規SS結合の導入による熱安定化に成功している。

[A novel engineered interchain disulfide bond in the constant region enhances the thermostability of adalimumab Fab.

Nakamura H, Oda-Ueda N, Ueda T, Ohkuri T. Biochem Biophys Res Commun. 2018. 495(1):7-11.]

さらに抗体医薬品の問題の１つである凝集性を抑えるために、アミノ酸変異による糖鎖付加Fabの作製を行い、凝集性を抑えることに成功している。

[Introduction of a glycosylation site in the constant region decreases the aggregation of adalimumab Fab.

Nakamura H, Oda-Ueda N, Ueda T, Ohkuri T. Biochem Biophys Res Commun. 2018. 503(2):752-756.]

現在、さまざまな変異体を作製し、Fabの熱安定化と凝集抑制に取り組んでいる。

　

　３）Fabの体内動態の改善

「Fabの血中滞留時間を延ばす」

Ｆａｂにポリエチレングリコール（PEG）を付加させて血中での滞留時間を伸ばすことは可能であるが、部位特異的にPEGを修飾させることが問題である。

我々はFabのC末端にフリーのSHをもたせ、熱安定性を損なわずに部位特異的にPEG化したFabの作製に成功している。

[C-Terminal Cysteine PEGylation of Adalimumab Fab with an Engineered Interchain SS Bond.

Nakamura H, Anraku M, Oda-Ueda N, Ueda T, Ohkuri T.

Biol Pharm Bull. 2020. 43(3):418-423.]

現在、他の分子と融合させ体内動態が改善するFabの作製に取り組んでいる。

　

４）Fabの抗原性に関する研究

「アミノ酸変異による抗原性の出現を回避する」

タンパク質製剤の問題点は抗原性である。

ヒトにマウス由来の抗体を投与すると、異物とみなされ免疫応答が起こる。

免疫応答が起こらないように、ヒトの配列の抗体医薬品が用いられている。

しかしアミノ酸変異により改変したFabは、抗原性が現れるおそれがある。

我々はモデルタンパク質を用いて、アミノ酸変異が安定性を上昇させる方向であれば抗原性が抑えられるという事を見い出した。

[A protein's conformational stability is an immunologically dominant factor: evidence that free-energy barriers for protein unfolding limit the immunogenicity of foreign proteins.

Ohkuri T, Nagatomo S, Oda K, So T, Imoto T, Ueda T. J Immunol. 2010. 185(7):4199-205. ]

[Relationship between the magnitude of IgE production in mice and conformational stability of the house dust mite allergen, Der p 2.

Nakamura H, Ohkuri T, So T, Ueda T. Biochim Biophys Acta. 2016 Oct;1860(10):2279-84.]

現在、Fabに対しても抗原性と抗体産生に相関があるかどうか調べている。

　

文責

崇城大学薬学部　生化学研究室

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